Hvad er peptidsyntese

 

Peptidsyntese er et aktivt felt inden for protein- og peptidkemi, som typisk involverer sekventiel tilføjelse af aminosyrer i en defineret rækkefølge for at danne peptidkæden ved kemiske metoder. De vigtigste syntesemetoder er væskefase- og fastfasesyntese. Sammenlignet med LPPS har SPPS fordelene ved at være hurtigere, enklere, med færre bivirkninger og højere udbytter.

 

Standard SPPS-metode, herunder Boc (benzyl) og Fmoc (tBu) strategier.

 

 

Boc (benzyl) strategi

I denne syntesetilgang anvendes chlormethyleret, hydroxymethyleret polystyren og p-methoxybenzyl (PMA) harpikser som faste bærere. -aminogruppen er beskyttet med t-butoxycarbonyl (Boc), mens sidekædegrupper af aminosyrer er beskyttet med benzylderivater. Boc-gruppen fjernes under anvendelse af ren TFA eller TFA i CH2Cl2, og ved slutningen af ​​syntesen fjernes sidekæde-beskyttelsesgrupper og peptid-harpiksbindinger med en stærk syre som vandfri flussyre (HF) eller TFMSA.

 

Fmoc (tBu) strategi

I denne syntesemetode bruges Wang-resin, 2-Chlorotrityl Chloride Resin, Rink amid-AM Resin, Rink amid-MBHA harpiks som faste understøtninger. -aminogruppen er beskyttet med 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) ), mens sidekædegrupper af aminosyrer er beskyttet med syrelabile beskyttelsesgrupper. Fmoc-gruppen fjernes under anvendelse af 20 % piperidin i DMF, og ved slutningen af ​​syntesen fjernes sidekæde-beskyttelsesgrupper og peptid-harpiksbindinger med 1 % -95 % TFA. Fmoc SPPS er i øjeblikket den foretrukne metode til peptidsyntese.

 

Grundlæggende principper for Fmoc-fastfase-peptidsyntese

 

Vælg Resin

De mest udbredte harpikser i Fmoc SPPS, herunder 4-Alkoxybenzylalkohol (Wang) harpiks, 2-Chlorotritylchloridharpiks, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA harpiks. Amidharpikser anvendes til syntese af peptider med påkrævet C-terminal amidering. Wang-harpiks og 2-Cl Trt-harpiks bruges almindeligvis til syntese af peptider med påkrævet C-terminal fri COOH. Men når C-terminalen af ​​peptidet har Pro og Gly som den første aminosyre, bør Wang harpiks ikke bruges på grund af risikoen for DKP (diketopiperazin) dannelse, 2-Chlorotrityl Chloride Resin anbefales til brug.

 

 

Vedhæftning af beskyttede aminosyrer til harpikser

Den første Fmoc-aminosyre er knyttet til en uopløselig støtteharpiks via en syrelabil linker.

 

Afbeskyttelse af -aminobeskyttelsesgruppen

Den midlertidige Fmoc-beskyttelsesgruppe ved N-terminalen af ​​peptidylharpiksen fjernes ved at behandle den med en opløsning af 20% piperidin i DMF. Denne reaktion afsluttes normalt inden for 10 til 20 minutter.

 

Vasketrin

Efter hver kemisk reaktion udføres vasketrin for at fjerne overskydende reagenser, biprodukter og uomsatte molekyler fra harpiksen. Dette hjælper med at opretholde renheden af ​​den voksende peptidkæde.

 

Aktivering og kobling af den beskyttede aminosyre

Den beskyttede aminosyre, der er bundet til harpiksen, aktiveres for at øge dens reaktivitet til kobling med den næste aminosyre i sekvensen. Almindelige aktiverende midler omfatter HOAT, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU og HATU. Kobling involverer dannelse af en peptidbinding mellem den aktiverede aminosyre og aminogruppen i den voksende peptidkæde. En Kaiser-test bruges typisk til at overvåge fuldstændigheden af ​​koblingsreaktioner.

 

Vasketrin

I lighed med tidligere vasketrin sikrer dette fjernelse af overskydende reagenser og biprodukter efter koblingsreaktionen.

 

Spaltning fra harpiks og afbeskyttelse af sidekædebeskyttelsesgrupper

Når først den ønskede peptidsekvens er syntetiseret på harpiksen, spaltes den fra den faste bærer ved hjælp af en spaltningscocktail såsom trifluoreddikesyre (TFA) indeholdende scavengers såsom thioanisol og vand. Samtidig fjernes sidekædebeskyttende grupper på aminosyrerester, hvilket afslører det fuldstændigt afbeskyttede peptid klar til oprensning og analyse.